研究背景

牛奶是日常不可缺少的高營養(yǎng)動物蛋白產(chǎn)品，全球人均奶年消費(fèi)量超過 100 公斤 / 年。許多因素都會影響奶牛的牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量，包括遺傳，管理和飼料喂養(yǎng)方式，據(jù)廣泛報(bào)道牛奶產(chǎn)量通常與牛奶蛋白質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。然而，根據(jù)研究者的發(fā)現(xiàn)，在相同的飲食和管理?xiàng)l件下飼養(yǎng)的奶牛，一些奶牛可以同時產(chǎn)生高產(chǎn)奶量和高乳蛋白含量的牛奶（MPY)。這是一個潛在的新性狀，乳制品生產(chǎn)商可能可以利用潛在的特性提高優(yōu)質(zhì)牛奶的產(chǎn)量。目前還不清楚瘤胃微生物及其代謝產(chǎn)物以及宿主代謝在多大程度上對 MPY 有貢獻(xiàn)。在此，研究者通過瘤胃代謝組學(xué)和代謝組學(xué)的分析，結(jié)合血清代謝組學(xué)，從瘤胃微生物組和宿主水平確定了 MPY 潛在的調(diào)控機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)方法

檢測方法：宏基因組測序 + 代謝組

實(shí)驗(yàn)儀器：Illumina Hiseq 3000(PE150)+ GC-TOF-MS

樣本分組：HH(高 MPY) 組 =10 例，LL(低 MPY) 組 = 10 例

有 4 個樣品（HH 樣品 3 個，LL 樣品 1 個）因提取 DNA 含量低而放棄

主要結(jié)果

瘤胃宏基因組分析

通過數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)瘤胃宏基因組包括 94.43%  的細(xì)菌、3.80%  的真核生物、1.41%  的古細(xì)菌和 0.16%  的病毒。

比較了兩個 MPY 組的瘤胃微生物群，古生菌在兩組間差異顯著（P <0.01，圖 1A）。PERMANOVA 分析表明，細(xì)菌和古生菌均存在顯著差異（P <0.01）。PCoA 分析顯示兩個 MPY 組之間基于細(xì)菌（圖 1B）和古生菌（圖 1C）的分離，未發(fā)現(xiàn)基于真核或病毒的分離。因此，兩組動物之間瘤胃微生物分類群的下游比較僅集中于細(xì)菌和古生菌。

圖 1   HH 和 LL 奶牛的微生物組成特征

HH 與 LL 奶牛瘤胃微生物群落組成特征及分類學(xué)差異

在細(xì)菌門水平的差異豐度比較分析中，LL 奶牛的瘤胃中擬桿菌門的豐度明顯更高，而 HH 奶牛的瘤胃中，變形桿菌門的含量顯著更高（調(diào)整后 P <0.05)。在種的水平上，15 個種在 HH 動物瘤胃中的豐度顯著高于 LL 動物（LDA>2，P<0.05)，23 種未分類擬桿菌在 LL 動物瘤胃中顯著富集（LDA>2，P<0.05；圖 2A)。

在古菌的差異豐度比較分析中，LL 牛瘤胃中豐富的廣古菌門的豐度顯著高于 LL 牛（P<0.01)。在屬的水平上，LL 牛瘤胃中古細(xì)菌屬甲烷短桿菌的豐度顯著高于 HH 牛（P<0.01)；在種的水平上，LL 牛瘤胃中 Methanobrevibacter millerae 豐度顯著高于 HH 牛  (LDA>2，P<0.05；圖 2B)。

圖 2   HH 和 LL 牛瘤胃細(xì)菌和古生菌種的差異

HH 和  LL  奶牛瘤胃微生物群功能特征及其差異性研究

在  KEGG  分析中，158 條內(nèi)源性三級通路被認(rèn)為是瘤胃微生物代謝通路。這些通路屬于 4 個一級類別，包括“代謝”（72.26±0.46%)、“遺傳信息處理”（19.08±0.12%)、“環(huán)境信息處理”（4.42±0.03%) 和“細(xì)胞過程”（4.24±0.04%)。在二級類別中，共觀察到 20 種類別，其中“碳水化合物代謝”（17.33±0.10%)、“氨基酸代謝”（15.96±0.11%)、“核苷酸代謝”（9.82±0.06%)、“復(fù)制與修復(fù)”（8.71±0.06%)、“能量代謝”（8.07±0.05%) 較為豐富。

比較已鑒定的 KEGG 通路時發(fā)現(xiàn) HH 奶牛瘤胃微生物群顯著富集的有 13 條三級通路，其中 2 條是“細(xì)胞過程”通路，2 條是“遺傳信息處理”通路，2 條是“環(huán)境信息處理”通路，7 條是“代謝”通路。而 18 條通路（包括 1 條“遺傳信息處理途徑”、2 條“細(xì)胞過程途徑”和 15 條“代謝途徑”）在 LL 動物的瘤胃中顯著富集（LDA>2 和 P <0.05；圖 3A)。當(dāng)比較上述不同的三級通路中涉及的 KEGG 模塊時，發(fā)現(xiàn)了 24 個 HH 富集的模塊和 19 個 LL 富集的模塊（圖 3B）。

圖 3   HH 和 LL 牛 KEGG 功能的差異

關(guān)于碳水化合物代謝和能量代謝，只有兩種下游功能（Ko00290 和 M00019，將丙酮酸轉(zhuǎn)化為纈氨酸和異亮氨酸）在 HH 奶牛的瘤胃中富集（圖 4A)。4 條通路和 2 個模塊在 LL 動物瘤胃中顯著富集（LDA>2，P<0.05)。這 4 條通路包括“糖酵解”（Ko00010)、“淀粉和蔗糖代謝”（Ko00500)、“半乳糖代謝”（Ko00052) 和“甲烷代謝”（Ko00680)。這 2 個模塊是“糖酵解”（M00001) 和“半乳糖降解”（M00632)。“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解”（Ko00280) 的下游功能也在 LL 牛的瘤胃中富集（圖 4B)。

圖 4  HH 和 LL 奶牛瘤胃碳水化合物代謝和能量代謝的微生物功能和種類

CAZyme 研究中，共鑒定出 313 個編碼 CAZymes 的基因，包括 8 個輔助活性（AAs），79 個碳水化合物結(jié)合模塊（CBMs），16 個碳水化合物酯酶（CEs），115 個糖苷水解酶（GHs），74 個糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）和 21 種多糖裂解酶（PLs）。其中編碼 GT2（8.64±0.04%）的基因占主要，其次是編碼 CE1（4.66±0.02%），GT4（4.34±0.02%），GH2（4.30±0.02%）和 GH3（4.16± 0.02%）的基因。

在涉及解構(gòu)碳水化合物（包括纖維素，半纖維素，淀粉，蛋白質(zhì)和木質(zhì)素）編碼 CAZymes 的基因中，18 種在 HH 奶牛的瘤胃中富集（15 GH、1 CE、1 PL 和 1  AA），而 34 種在 LL 奶牛的瘤胃中富集（27 GH、4 CE、2 PL 和 1  AA）。

在 GTs（涉及碳水化合物的合成）中，有 11 種在 HH 奶牛的瘤胃中富集，而有 2 種富在 LL 奶牛的瘤胃里富集。

關(guān)于 CBMs，涉及復(fù)雜碳水化合物降解相關(guān)的非催化型酶，在 HH 牛的瘤胃中富含 3 種，而在 LL 牛的瘤胃中富含 19 種。

微生物種類與功能的關(guān)系

由于蛋白質(zhì)含量是 MPY 的決定性指標(biāo)之一，因此研究者更多的關(guān)注在瘤胃微生物組中氨基酸代謝的功能。研究發(fā)現(xiàn)涉及支鏈氨基酸（BCAA）代謝的 2 個重要通路（圖 5A）：“纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成”（ko00290）和“纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的降解”（ko00280）。對這 2 條通路的編碼酶基因豐度進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，HH 牛瘤胃中參與支鏈氨基酸生物合成的編碼酶基因豐度均顯著高于 LL 牛（P<0.05)，而參與支鏈氨基酸降解的編碼酶基因豐度在 LL 牛瘤胃中均顯著升高（P<0.05)。

細(xì)菌種類與這兩條支鏈氨基酸通路之間的 Spearman 相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)的建立，以探討瘤胃細(xì)菌種類對微生物支鏈氨基酸功能的影響。共有 24 個種與 2 條支鏈氨基酸途徑有顯著的相關(guān)性（R>0.50,P<0.05)，13 個種與支鏈氨基酸生物合成途徑（Ko00290) 呈正相關(guān)。在 13 個菌種與 Ko00290 之間的正相關(guān)中，較強(qiáng)的是包括 P.multisaccharivorax, P. histicola, P. maculosa, P. buccae,  以及  P. albensis  在內(nèi)的 5 種普氏桿菌屬（圖 5B)。

圖 5A  支鏈氨基酸的生物合成和降解途徑

圖 5B  顯著不同的菌種與 2 條支鏈氨基酸途徑之間存在關(guān)聯(lián)的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖

代謝組分析

在瘤胃代謝物中共鑒定出 263 種化合物。對瘤胃代謝物的相對濃度進(jìn)行 t 檢驗(yàn)和 VIP 篩選后，25 種代謝物在兩個 MPY 組間差異顯著（P<0.05，VIP>1；圖 6A)，HH 牛瘤胃中 25 種代謝物的相對濃度顯著高于 LL 組（P<0.05，VIP>1；圖 6A)。基于這 25 種顯著不同瘤胃代謝產(chǎn)物的代謝通路分析（MetPA) 顯示，有 10 條通路富集（圖 6B)，其中“維生素 B6 代謝”、“甘油脂代謝”和“β- 丙氨酸代謝”是顯著不同的通路（FDR<0.01,pathway impact>0.1)。

瘤胃代謝組還用于表型（MPY) 關(guān)聯(lián)分析，檢測到 126 個與 MPY 相關(guān)的代謝型。126 個 MPY 代謝型用于 PERMANOVA 分析，其中 106 個 MPY 代謝型（均為 MPY 陽性代謝型）與瘤胃菌群變化相關(guān)（P<0.05)。這 106 個 MPY 陽性代謝型被認(rèn)為是瘤胃微生物組響應(yīng)的代謝型，然后發(fā)現(xiàn)它們與 43 個微生物模塊顯著相關(guān)（P<0.05)。除了代謝組學(xué)鑒定的瘤胃小分子的相對濃度外，還量化了總揮發(fā)性脂肪酸（VFAS)、丙酸、戊酸和異戊酸的 JUé對濃度（圖 6C,D)，并在 HH 奶牛中得到了顯著的提高（P<0.05)。

圖 6  HH 牛和 LL 牛的瘤胃代謝組

對于血清代謝組，研究者分析了先前研究中鑒定的 176 種化合物。比較分析表明，HH 奶牛血清中 19 種代謝物的相對濃度明顯更高（P<0.05)，LL 奶牛血清中 12 種代謝物的相對濃度顯著升高（P<0.05，VIP>1；圖 7A)。

將上述 31 種不同濃度的代謝物用于 MetPA 分析，揭示了 12 條通路的富集（圖 7B)，其中“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”、“煙酸和煙酰胺代謝”、“鞘脂代謝”、“氨基酰 tRNA 生物合成”和“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解”是顯著不同的通路（FDR <0.01, pathway impact>0.1）。

圖 7   HH 和 LL 牛的血清代謝組

將血清代謝組用于表型（MPY) 關(guān)聯(lián)分析，將血清代謝物鑒定為 MPY 陽性代謝型（21 種代謝物）或 MPY 陰性代謝型（14 種代謝物）。

為了確定瘤胃和血清中的 MPY 相關(guān)代謝物是否相關(guān)，研究者比較了瘤胃和血清中的代謝物，包括兩個 MPY  組之間顯著差異的代謝物、MPY 陽性代謝型和 MPY  陰性代謝型等。差異代謝物的 Venn 圖顯示，月桂酸的脂肪酸是瘤胃和血清共有的（圖 8A）。對于差異代謝通路，HH  奶牛瘤胃和血清中的“嘧啶代謝”、“甘油脂代謝”和“淀粉和蔗糖代謝”三個途徑是共有的（圖 8B）。MPY 相關(guān)代謝型的  Venn 圖顯示，“精氨酸和脯氨酸代謝”、“氨基酰基轉(zhuǎn)移酶合成”和“嘌呤代謝”是瘤胃和血清 MPY  陽性代謝型共有的（圖 8C）。

圖 8A  Venn 圖顯示不同 MPY 組之間瘤胃和血清中的代謝物存在顯著差異。

圖 8B  Venn 圖顯示關(guān)鍵通路（基于顯著差異的代謝物而富集）

圖 8C  Venn 圖顯示瘤胃和血清中存在  MPY  陽性和  MPY 陰性代謝產(chǎn)物熱圖顯示每個樣本中每個代謝物集的  Z  分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)換豐度

瘤胃微生物組，瘤胃代謝組和血清代謝組之間的關(guān)系及其對 MPY 的解釋性

瘤胃微生物群與瘤胃代謝產(chǎn)物之間的 spearman 相關(guān)性分析：結(jié)果顯示有 65 個顯著相關(guān)（R>0.50，P<0.05；圖 9A)。在 65 種相關(guān)性中，主要 11 個種普氏菌種與氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、有機(jī)化學(xué)物質(zhì)呈正相關(guān)（0.50

瘤胃微生物群和血清代謝物之間的 Spearman 相關(guān)性分析（圖 9B)：與瘤胃微生物群和瘤胃代謝產(chǎn)物之間確定的關(guān)系相比，存在的關(guān)系較少。瘤胃微生物群與血清 MPY 相關(guān)的代謝型之間的關(guān)系表明，7 個普氏菌種參與幾種氨基酸代謝的代謝型呈正相關(guān)，這些氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸和蛋氨酸（圖 9D）。

圖 9    瘤胃代謝組、代謝組和血清代謝組之間的相互作用

利用線性混合效應(yīng)模型進(jìn)一步分析了瘤胃微生物組成、功能、代謝產(chǎn)物和血清代謝產(chǎn)物對宿主  MPY  的貢獻(xiàn)率分別為 17.81%、21.56%、29.76%  和 26.78%（圖 10）。

圖 10  本研究流程圖

結(jié)論

這些發(fā)現(xiàn)為在相同管理?xiàng)l件下微生物組依賴性和寄主依賴性機(jī)制如何促進(jìn)奶牛產(chǎn)奶質(zhì)量的不同個性化表現(xiàn)提供了基本理解。這些基本信息對于開發(fā)通過高精度喂養(yǎng)提高牛奶質(zhì)量和產(chǎn)量的潛在操作策略至關(guān)重要。

參考文獻(xiàn)：Ming-Yuan Xue, Hui-Zeng Sun, Xue-Hui Wu, et al. Multi-omics reveals that the rumen microbiome and its metabolome together with the host metabolome contribute to individualized dairy cow performance. Microbiome.2020; 12;8(1):64