單細胞基因表達 Flex 是 10x Genomics 于 2022 年 3 月推出的新產(chǎn)品（原 Fixed RNA），通過探針雜交的方式捕獲靶基因，再進行細胞捕獲建庫測序的新技術(shù)。該技術(shù)可鎖定 RNA 的瞬時表達狀態(tài)，解決了單細胞樣本儲存運輸、多樣本批量處理以及混樣測序的問題，讓單細胞轉(zhuǎn)錄組的研究更加靈活。

針對 FFPE 切片，使用二甲苯脫蠟，使用膠原酶、胰蛋白酶等多種酶來消化組織，制備單細胞懸浮液，進而抽核得到細胞核樣本；建庫時采用靶向基因的探針對雜交目標 RNA 分子后連接的原理，進而完成文庫構(gòu)建的過程；該方法可以用來分析數(shù)千個至數(shù)萬個細胞核的基因表達，能夠?qū)θ嘶蛐∈蟮?FFPE 樣本進行單細胞轉(zhuǎn)錄組分析。

單細胞基因表達 Flex 是基于探針雜交原理，簡單來說就是對已知序列設(shè)計探針，然后將成對的探針與 RNA 進行原位雜交，之后對探針進行擴增，然后用 Gel Beads 捕獲探針進行建庫測序。

 ▲上圖 單細胞基因表達 Flex 的探針雜交原理

首先，將 FFPE 樣本制備成細胞核懸液，然后加入探針進行探針的雜交。如果是多樣本混樣，則需要在雜交后對樣本進行等細胞數(shù)量的混合。混合計數(shù)之后取一定數(shù)量的細胞懸液進行上機捕獲，在 PCR 儀中進行探針的連接和延伸。隨后進行文庫的構(gòu)建和測序到最后的數(shù)據(jù)分析。

▲上圖   單細胞基因表達 Flex 工作流程

單細胞 RNA 測序研究的范圍和規(guī)模正在不斷擴大，研究人員的目標是根據(jù)患者隊列或多個治療條件或時間點來分析更多的樣本。Chromium 單細胞基因表達 Flex 分析不僅能對新鮮樣本開展單細胞基因表達分析，還能對 PFA 固定樣本及 FFPE 細胞和組織進行分析。尤其是 Flex 技術(shù)實現(xiàn)了 FFPE 樣本在單細胞水平的研究，可以解鎖大量儲存在醫(yī)院以及生物樣本庫中的 FFPE 樣本的寶貴信息。

（1）擴大了樣本范圍：能對 FFPE 細胞和組織，以及 PFA 固定樣本進行單細胞測序分析，而不再受限于是否有新鮮組織可用，可以解鎖大量儲存在醫(yī)院以及生物樣本庫中的 FFPE 樣本的寶貴信息。

（2）簡化了工作流程：FFPE 樣本比較容易獲取，易運輸，并且樣本收集相對經(jīng)濟成本低。使樣本采集更加靈活，實驗時間安排更加方便。

（3）提升了低表達基因檢測靈敏度：根據(jù) Flex 和單細胞 3RNA 的實測數(shù)據(jù)對比結(jié)果，在多種樣本類型中，相同的測序數(shù)據(jù)量下，F(xiàn)lex 所得的測序數(shù)據(jù)飽和度更高，探針靈敏度更強，單個細胞內(nèi)可以檢測到的基因數(shù)更多。

（4）與 10x Visium FFPE 空間轉(zhuǎn)錄組更配：Flex 技術(shù)與 10x 推出的 FFPE 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)完美結(jié)合，能夠通過同一套探針對同一 FFPE 樣本進行單細胞轉(zhuǎn)錄組與空間轉(zhuǎn)錄組研究，基因表達一致性更高，數(shù)據(jù)聯(lián)合分析匹配性更好。

由于需要捕獲探針捕獲基因進行建庫，因此需要有配套的探針的物種才可以開展實驗。目前單細胞 Flex RNA 僅適用于人類和小鼠，并且只能進行基因表達應用（不能進行 ATAC-Seq 或 VDJ 測序）。對于 FFPE 樣本，由于受蠟塊年齡、組織類型、固定前組織質(zhì)量、組織密度、組織面積以及其他因素的影響，致使相同面積和厚度的組織解離后獲取的細胞數(shù)量也會存在較大差異。

1、FFPE 樣本量要求

石蠟塊： 蠟塊被包埋組織體積需要 >0.5cm³

石蠟卷： 厚度 25μm 或 50μm 石蠟卷 3 卷以上，不可小于 25μm；被包埋組織橫截面積需 >0.3 cm² 蠟卷完整不破碎，放入 1.5ml EP 管中，4 度避光保存和運輸。石蠟卷如破碎較為嚴重，說明樣本脆性較大，會影響樣本質(zhì)量。注：某些組織類型由于同等體積下細胞數(shù)量較少，可能需要提供更多蠟卷，例如穿刺樣本、脂肪組織、肺癌、心肌等。

FFPE 保存年限：無明確年限要求，10x Genomics 已測試過長達 11 年的樣本；已有文獻表明相對于保存時間，固定時間對 RNA 質(zhì)量影響更大（Trinks A，2024；Yunxia Guo，2023）。

2、FFPE 組織切片的細胞產(chǎn)量

在單個孔中可以檢測多達 10,000 個細胞 / 核，即每個芯片最多可檢測 80,000 個細胞。然而，裝載的細胞或細胞核越多，可能出現(xiàn)的多胞率就越多。此外，更多的細胞意味著需要更高的測序數(shù)據(jù)量。一個常見的目標是每孔 8000 個細胞 / 核。10x 給出了一個樣本準備推薦表，給出了樣本類型，石蠟卷張數(shù)和橫切面面積，以及相對應的細胞核得率。在這個表的基礎(chǔ)上可以預估一下需要的蠟卷數(shù)量和厚度，最后兩列細胞核的數(shù)量是 10x 用他們自己的方法做出來的細胞得率，伯豪生物用的是自己研發(fā)的方法抽核，細胞核得率和質(zhì)量更有保證。

圖 10x 給出的特定組織類型 / 切片的近似細胞產(chǎn)量

3、FFPE 組織核酸質(zhì)量要求

核酸質(zhì)檢需要 DV200>30%（DV200 指長度大于 200nt 的 RNA 片段占總的 RNA 片段的比例）

4、FFPE 樣本細胞核懸液的質(zhì)控要求

因為要進行探針雜交，雜交結(jié)束要洗好幾遍，中間會損失很多細胞核。所以單細胞核懸液中的細胞核總數(shù)量要大于 30 萬個，而且核膜完整度 >80%，結(jié)團率 <10%。除此，還要求抽核后背景干凈雜質(zhì)少，雜質(zhì)多的話會拉低中位基因數(shù)同時會有游離 RNA 的污染。

▲上圖 解離后（左）和雜交后洗滌后的細胞計數(shù)（雜交后洗滌可減少碎片）

﹂數(shù)據(jù)來源：互聯(lián)網(wǎng)「2015 年 -2024 年」上海伯豪生物技術(shù)有限公司協(xié)助客戶項目發(fā)文。