單細(xì)胞 RNA-seq 技術(shù)已經(jīng)在繪制器官基因表達(dá)譜研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但目前很難系統(tǒng)地鑒定和定位單個(gè)器官中所有分子細(xì)胞的類型，并創(chuàng)建完整的分子細(xì)胞圖譜。近期發(fā)表的研究成果中，多個(gè)細(xì)胞類型特異性標(biāo)記分子被識(shí)別出來，為細(xì)胞類型的分子定義和功能研究提供了幫助。

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近日，美國斯坦福大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞 RNA-seq 分析創(chuàng)建了一個(gè)全面的成人肺分子細(xì)胞圖譜。該研究共對人類肺部組織和循環(huán)血液中的約 75,000 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了測序，并結(jié)合多方面的細(xì)胞注釋方法，鑒定出肺部的 58 種細(xì)胞類型。該研究成果已發(fā)表在尖端期刊 Nature 上，文章題為“A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing”。

研究團(tuán)隊(duì)獲取了人肺部的正常組織，包括支氣管（近端）、細(xì)支氣管（中端）和肺泡（遠(yuǎn)端）區(qū)域以及外周血。樣本處理成細(xì)胞懸液后，被分為上皮細(xì)胞（EPCAM+）、內(nèi)皮細(xì)胞 / 免疫細(xì)胞（CD31+/CD45+）和基質(zhì)細(xì)胞（EPCAM-、CD31-、CD45-）。該研究利用 10x Chromium 發(fā)現(xiàn)罕見細(xì)胞類型，再通過 SmartSeq2 獲得更深入的轉(zhuǎn)錄信息。通過基于液滴和孔板的單細(xì)胞 RNA 測序（droplet- and plate-based single-cell RNA sequencing），研究團(tuán)隊(duì)對所有肺組織間室和循環(huán)血液中的約 75,000 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了測序，結(jié)合多種細(xì)胞注釋方法，繪制了一個(gè)全面的人肺分子細(xì)胞圖譜。

該圖譜揭示了人類肺部 58 個(gè)細(xì)胞群的基因表達(dá)譜和解剖位置，包括 45 種已知細(xì)胞類型中的 41 種和 14 種未知細(xì)胞類型。這 58 種分子類型細(xì)胞包括 15 種上皮細(xì)胞，9 種內(nèi)皮細(xì)胞，9 種基質(zhì)細(xì)胞和 25 種免疫細(xì)胞。

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▲圖 1. 通過迭代聚類發(fā)現(xiàn)組織細(xì)胞的 scRNA-seq 譜。來源：Nature

該圖譜定義了幾乎所有典型肺細(xì)胞類型（91%）的全基因組表達(dá)譜，從豐富的（毛細(xì)血管，約占肺細(xì)胞的 23%）到極其罕見的（離子細(xì)胞，約占 0.01%）。其中，1/ 4 的細(xì)胞類型此前缺乏高質(zhì)量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)通過對 21 種已分類的人類血細(xì)胞進(jìn)行 RNA 測序，定義了循環(huán)免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜。在肺和血液單細(xì)胞 RNA-seq 分析中，使用了典型免疫標(biāo)記和差異表達(dá)基因 panel 來分配 25 個(gè)免疫細(xì)胞簇。

▲圖 2. 人類肺免疫分子類型聚集與注釋。來源：Nature

該分子圖譜可鑒定肺細(xì)胞的生化功能和轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)記。分析發(fā)現(xiàn)，三組細(xì)胞簇（增殖基底 v 細(xì)胞、增殖自然殺傷 / T 細(xì)胞、增殖巨噬細(xì)胞）的周期基因表達(dá)豐富，表明它們是 zuì富增殖能力的肺細(xì)胞類型。研究發(fā)現(xiàn)了兩簇肺泡 2 型（AT2）細(xì)胞，可以產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，防止肺泡塌陷。這些細(xì)胞混雜在肺泡上皮中。此外，研究團(tuán)隊(duì)在肺內(nèi)皮腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)了意想不到的分子多樣性，并鑒定了新基質(zhì)類型。兩個(gè)簇表達(dá)經(jīng)典成纖維細(xì)胞標(biāo)記物（BSG 和 COL1A2），其中一個(gè)簇定位于肺泡，另一個(gè)簇定位于血管外膜和鄰近氣道。

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▲圖 3. AT2 標(biāo)記表達(dá)的點(diǎn)圖（10x 數(shù)據(jù)集）與 smFISH 和細(xì)胞定量評(píng)分。來源：Nature

利用該圖譜，研究團(tuán)隊(duì)確定了受肺部疾病基因和呼吸道病毒直接影響的細(xì)胞類型，并分析了 233 個(gè)現(xiàn)存肺部疾病基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，可以確定疾病的細(xì)胞起源。該數(shù)據(jù)可支持 12 種疾病 27 個(gè)基因的已知或疑似“罪魁禍?zhǔn)住奔?xì)胞，并確定了 15 種疾病涉及 21 個(gè)基因的細(xì)胞類型，包括肺動(dòng)脈高壓的周細(xì)胞、房室發(fā)育不良的毛細(xì)血管和慢性阻塞性肺病（COPD）的 AT2 細(xì)胞。同時(shí)，該圖譜還繪制了 80 個(gè)編碼病毒受體基因的表達(dá)情況，其中包括呼吸道病毒的 26 個(gè)基因。

通過比較人類和小鼠的數(shù)據(jù)，該研究確定了 17 種在肺進(jìn)化過程中獲得或丟失的分子細(xì)胞類型，及表達(dá)譜發(fā)生重大變化的分子細(xì)胞類型，揭示了細(xì)胞類型和細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)在器官進(jìn)化過程中的廣泛可塑性，包括細(xì)胞類型之間的表達(dá)轉(zhuǎn)換。

▲圖 4. 肺細(xì)胞類型和表達(dá)模式的進(jìn)化差異。來源：Nature

研究團(tuán)隊(duì)表示，這是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)，因?yàn)椴煌?xì)胞類型具有不同的結(jié)構(gòu)、位置和豐度，其變化范圍超過 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。該分子細(xì)胞圖譜可為監(jiān)測肺部所有細(xì)胞類型以及它們在發(fā)育、衰老、疾病和進(jìn)化過程中如何變化提供標(biāo)記和基準(zhǔn)，以及為研究肺細(xì)胞功能和相互作用提供了分子基礎(chǔ)，將對肺相關(guān)生理學(xué)和醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生廣泛影響。

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