腫瘤內(nèi)異質(zhì)性對癌癥患者的準(zhǔn)確診斷和建立個性化治療策略帶來了重大挑戰(zhàn)。這種異質(zhì)性可能是治療耐藥性、疾病進展和癌癥復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)。為了提高免疫治療效果， 研究人員使用 空間轉(zhuǎn)錄組 技術(shù)（spatial transcriptome，ST) 來識別，阻斷腫瘤異質(zhì)性的來源，提供識別新的生物標(biāo)志物的能力，并深入了解腫瘤細(xì)胞、脂肪組織、血管、三級淋巴結(jié)構(gòu)和 TME 間基質(zhì)之間的動態(tài)相互作用。 目前多項技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于癌癥組織內(nèi)的這種分析，包括，原位雜交，數(shù)字空間分析以及一種新興技術(shù)的 10×Genomics Visium 空間基因表達解決方案。10×Genomics Visium 產(chǎn)生定量基因表達數(shù)據(jù)，并將它們映射到組織結(jié)構(gòu)上。通過保留空間信息可以很好地識別新的生物標(biāo)志物，該技術(shù)可能會影響新的組合免疫療法。

多重免疫組化 / 免疫熒光（mIHC/IF) 是一種常用的工具，可同時檢測單個組織樣本中多達 40 個感興趣的標(biāo)記物。與單獨分析腫瘤突變負(fù)荷（TMB) 或基因表達譜（GEP) 相比，這種方法能更好地預(yù)測細(xì)胞對 PD-1/PD-L1 治療的反應(yīng)。

下面為大家介紹幾種空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，及各種技術(shù)的特點：

01、 原位雜交技術(shù)（In Situ Hybridization，ISH）

原位雜交（ISH) 是一種在細(xì)胞或組織中可視化特定 DNA 或 RNA 分子的分子技術(shù)。ISH 是基于互補性質(zhì)的 DNA/DNA 或 DNA/RNA 雙鏈和標(biāo)記核酸探針的原位雜交到靶序列上。通過這種方式，我們可以獲得有用的空間信息。傳統(tǒng)方法，核酸探針附著在放射性標(biāo)簽上。目前這種方法已被螢光顏料所取代。也就現(xiàn)在大家所熟知的熒光原位雜交技術(shù)（FISH）。FISH 本身已經(jīng)進一步發(fā)展成為一種被稱為多重單分子 FISH (smFISH) 的技術(shù)，它能夠在單分子分辨率下同時檢測大約 10,000 個基因和每個細(xì)胞大約 70,000-100,000 個 RNA 分子。下面為大家概述每種技術(shù)的基本原理：

熒光原位雜交（FISH）

FISH 是檢測微生物、診斷實體癌癥和血液癌癥以及指導(dǎo)癌癥治療的有用的臨床工具。例如，F(xiàn)ISH 已被常規(guī)用于檢測慢性髓系白血病中的 BCR-ABL1 t(9;22) 易位和各種癌癥中的許多融合基因。FISH 還被用于確認(rèn)乳腺癌中的人表皮生長因子受體 2  (HER2) 基因擴增，從而識別有可能從曲妥珠單抗（一種針對 HER2 的單克隆抗體治療）中獲益的患者。隨著更多免疫療法的開發(fā)和批準(zhǔn)，研究人員已經(jīng)尋求使用 FISH 來預(yù)測癌癥免疫治療的反應(yīng)性。為了擴大 FISH 的有效性，將 FISH 與 IHC 或 IF 結(jié)合，同時檢測不同細(xì)胞類型的 RNA 和蛋白質(zhì)，可以更好地來表征 TME。

Single-Molecule FISH（smFISH）和 RNAscope

為了解決傳統(tǒng) FISH 的局限性，研究工作已經(jīng)從 DNA 研究轉(zhuǎn)向了單分子 RNA 的研究，并且使用高通量的方法。由此產(chǎn)生的技術(shù)，稱為單分子 FISH (smFISH)，允許研究人員可視化和量化單個 mRNA 分子，并表征內(nèi)源性基因表達的空間模式。

RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA) 是一種商業(yè)化的基于 ISH 的技術(shù)，使用分支 DNA 和信號放大實現(xiàn)比傳統(tǒng) FISH 更好的靈敏度和特異性：通過這種方法，研究人員可以在抑制背景噪聲的同時檢測和量化低含量的 mRNA。這種方法可以檢測多達 12 種不同的 RNA 靶點，可以方便地與免疫組化和 / 或 IF 結(jié)合，以自動化的方式同時研究 RNA 和蛋白質(zhì)。RNAscope 相對于其他基于 FISH 的技術(shù)的一個主要優(yōu)勢是，13000 個 RNA 探針已經(jīng)被設(shè)計并通過商業(yè)建立的協(xié)議進行驗證；因此，它是一種用于研究和臨床實驗室的省時和友好的方法。通過檢測一種感興趣的特定 RNA, RNAscope 已經(jīng)揭示了 TME、免疫逃逸機制和新的預(yù)測和預(yù)后癌癥生物標(biāo)志物。

Multiplexed smFISH

雖然研究人員可以通過 RNAscope 等技術(shù)獲得更高的敏感性和特異性，但需要一種基于 FISH 的高通量轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)來更好地表征具有獨特基因表達譜的罕見細(xì)胞群和細(xì)胞類型。比如多重糾錯 FISH(MERFISH) 和序列 FISH(seqFISH)，不僅提供了改進的 RNA 定量、信號放大和檢測，而且更重要的是，提供了基于圖像的轉(zhuǎn)錄組分析。

MERFISH 由 smFISH 改良而來，采用基于條形碼的組合標(biāo)記方法，隨后進行多輪雜交，以確保高水平的熒光信號亮度和可同時檢測到的大量 RNA (圖 1)。MERFISH 可以實現(xiàn)接近全基因組分析和 90% 的檢測效率，在人類骨肉瘤細(xì)胞中已經(jīng)證明。與傳統(tǒng)的 FISH 相比，MERFISH 還提供了額外的好處，即能夠以低豐度量化單個 RNA 分子。

圖  MERFISH 原理

seqFISH 是另一種多重 smFISH 技術(shù)，它是基于連續(xù)多輪的條形碼雜交標(biāo)記技術(shù)。它可以提供亞衍射極限的空間分辨率，優(yōu)于其他 RNA 分析技術(shù)。例如，seqFISH 對小鼠胚胎干細(xì)胞和腦組織中的 10000 種 mRNA 進行了高精度、高分辨率的成像。Zhou 等人證明 seqFISH 是一個研究和獲得 t 細(xì)胞成熟過程中調(diào)控基因表達動態(tài)的強大工具。Voith von Voithenberg 等人將微流體技術(shù)與多路 smFISH 相結(jié)合，研究乳腺癌中的腫瘤異質(zhì)性。

圖  seqFISH 原理

smFISH 和多重 smFISH 是單細(xì)胞 RNA 測序研究和量化細(xì)胞 RNA 的替代方案，因為它提供了單細(xì)胞甚至單分子水平上的亞細(xì)胞空間信息。然而，盡管基于 smFISH 的多重技術(shù)很有前景，但由于復(fù)雜的探針設(shè)計、驗證、圖像分析和解碼，它還沒有廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)化研究或臨床設(shè)置。通常使用非多重 FISH、定量 PCR、免疫組化、IF 等方法在 mRNA 或蛋白水平上研究單個基因表達更為方便，特別是當(dāng)研究的基因數(shù)量較小時，如一套預(yù)后標(biāo)志物。另一個限制是，與其他技術(shù)相比，因為序列雜交，成像時間加起來至少 18 h，還不包括 36-48 h 的探針雜交時間，導(dǎo)致整體的通量較低  (表）。此外，多重 smFISH 技術(shù)只能評估新鮮冷凍組織中一種類型的分析物，如 RNA。新興的技術(shù)，如數(shù)字空間分析，可以評估新鮮冷凍組織和病理醫(yī)師經(jīng)常使用的標(biāo)準(zhǔn)福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE) 組織中的蛋白質(zhì)和 RNA 水平。

表：多種空間轉(zhuǎn)錄成像技術(shù)對比

02、 空間轉(zhuǎn)錄組（Spatial Transcriptomics，ST）

在單細(xì)胞 RNA 測序過程中，空間信息丟失。盡管該技術(shù)被廣泛用于探索單細(xì)胞水平的基因表達譜，但它的捕獲效率和測序覆蓋率較低，以及高丟失率，這些都可能影響后續(xù)數(shù)據(jù)的分析和解釋。

隨著一家名為“空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)”（Spatial Transcriptomics，Stockholm, Sweden) 的公司率先開發(fā)的技術(shù)的發(fā)展，空間基因組學(xué)這一新興領(lǐng)域進入了人們的視線。該技術(shù)利用空間條形碼寡脫氧胸腺嘧啶微陣列實現(xiàn)完整組織切片中的轉(zhuǎn)錄組定量可視化和分析。在進行 RNA 測序過程之前，將獨特的位置條形碼引入玻片，以保持組織結(jié)構(gòu)中的空間位置。

圖 Visium Spatial Gene Expression Solution 原理

這項新技術(shù)首先在小鼠嗅球上進行，包括組織包埋，組織切片、固定、蘇木精和伊紅（H&E) 染色、亮視野成像、組織通透化、cDNA 合成、組織移除、探針釋放、文庫準(zhǔn)備、測序、數(shù)據(jù)處理、數(shù)據(jù)可視化和分析。值得注意的是，該工作流程的一個顯著特征是能夠生成帶有保留空間信息的載玻片 cDNA 文庫，使其能夠可視化地將基因表達譜映射到相應(yīng)的組織形態(tài)。

目前該技術(shù)已經(jīng)用于多種疾病類型，包括研究人員在乳腺癌、前列腺癌和皮膚惡性黑色素瘤活檢中發(fā)揭示了腫瘤內(nèi)部及之間的異質(zhì)性，以及癌和癌旁間差異的基因表達譜。當(dāng)然，組織病理學(xué)注釋和單細(xì)胞 RNA 測序可以分別識別異常的組織形態(tài)和確認(rèn)存在遺傳上不同的細(xì)胞群；然而，ST 可以根據(jù)基因表達譜來識別不同的空間區(qū)域。 基于空間轉(zhuǎn)錄組公司首創(chuàng)的概念，10X genomics 公司發(fā)布了 Visium Spatial Gene Expression Solution (10×Genomics, USA)，與第一代 ST 技術(shù)相比，Visium Spatial Gene Expression Solution 具有更高的分辨率和更高的靈敏度。 為了進一步挖掘 ST 的潛力，研究人員近開發(fā)了一種被稱為多模態(tài)交叉分析（MIA) 的分析方法。MIA 結(jié)合了單細(xì)胞 RNA 測序和 ST 技術(shù)生成的數(shù)據(jù)集，可以將細(xì)胞定位到組織上特定的區(qū)域。

盡管 10X genomics 公司發(fā)布了 Visium Spatial Gene Expression Solution 為科學(xué)研究帶來了很大的希望，但它仍然有局限性。 首先，盡管官方推薦的組織切片厚度是 10μm，但是這個值還要取決于組織類型和成分。10×Genomics 提供了一個支持網(wǎng)站，上面提供了兼容組織和相應(yīng)厚度的更新列表。到目前為止，已經(jīng)列出了 4 種大鼠組織、20 種小鼠組織和 19 種人類組織，還有 4 種組織計劃進一步優(yōu)化。此外，10×Genomics 還被建議對每一種新的組織類型進行一次優(yōu)化實驗，因為組織通透性條件在組織、物種甚至實驗室之間是不同的。其次，Visium 僅在新鮮冷凍標(biāo)本中得到驗證，針對于 FFPE 標(biāo)本的解決方案也會在不久后推出。每個組織捕獲區(qū)域包含~ 5000 個 spot 點，根據(jù)組織類型和厚度的不同，每個點可以捕獲 1 -10 個細(xì)胞。 雖然有些人可能認(rèn)為這項技術(shù)令人滿意，但在需要獲得詳細(xì)細(xì)胞類群信息時仍需要做額外的工作。先進的解決方案是將 MIA 分析方法集成到分析工作流中，以允許在細(xì)胞級別進行識別。盡管存在這些限制，但由于 visium 可以迅速識別基因表達譜，并在不丟失空間信息的情況下檢測出癌癥起始和進展的新特征， 因此 10×Genomics visium 技術(shù)是目前有潛力及前景的技術(shù) 。

參考文獻：

Nerurkar S N, Goh D, Cheung C C L, et al. Transcriptional Spatial Profiling of Cancer Tissues in the Era of Immunotherapy: The Potential and Promise[J]. Cancers, 2020, 12(9): 2572.

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