生命科學(xué)研究技術(shù)在不斷發(fā)展和進(jìn)步，生物學(xué)的研究層面也在不斷拓展，從組織到細(xì)胞再到細(xì)胞的空間分布定位，生命科學(xué)的研究正在進(jìn)行從二維到三維的巨變。空間轉(zhuǎn)錄組是這一轉(zhuǎn)變的引領(lǐng)者之一。

文章展示

文章題目：Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex

雜志名稱：BioRxiv

發(fā)表單位：約翰霍普金斯大學(xué)，10x Genomics

發(fā)表時間：2020.02.28

主要技術(shù)：10x Genomics Visium 空間基因表達(dá)解決方案

Pick 理由：首篇應(yīng)用 10x Genomics Visium 技術(shù)的文章

技術(shù)背景

人類大腦結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，一般認(rèn)為大腦的空間結(jié)構(gòu)與大腦的功能密切相關(guān)，大腦的不同區(qū)域?qū)?yīng)著不同的功能，然而常規(guī) scRNA-seq 測序數(shù)據(jù)丟失了細(xì)胞的空間位置信息。

另外由于大腦神經(jīng)元比較脆弱，目前多數(shù) scRNA-seq 的組織消化方式難以保證大量神經(jīng)元的存活，同時由于大腦組織的特殊性，許多樣本經(jīng)過冰凍處理，只能使用 snRNA-seq 抽細(xì)胞核的方式獲取數(shù)據(jù)。這種方式則丟失了細(xì)胞質(zhì)及軸突和近端樹突信息，而越來越多的文獻(xiàn)研究結(jié)果表明，snRNA-seq 方法遺漏的核外信息可能與理解大腦疾病的遺傳風(fēng)險特別相關(guān)。

10x Genomics Visium 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在玻片上合成 cDNA, 克服了 scRNA-seq 和 snRNA-seq 技術(shù)的局限性，既保留了細(xì)胞空間坐標(biāo)也保留了組織中完整的細(xì)胞內(nèi)信息。

今天分享的文章就是應(yīng)用 10x Genomics Visium 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)表的首篇文章。

主要研究成果

鑒定了人腦組織中層富集（layer-enriched）基因，描繪了 DLPFC 基因表達(dá)圖譜

單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合 snRNA-seq 數(shù)據(jù)加強(qiáng)了細(xì)胞空間注釋準(zhǔn)確性

通過整合分析神經(jīng)精神病基因集發(fā)現(xiàn)人腦組織中層富集（layer-enriched）基因和精神分裂癥及自閉癥譜系障礙相關(guān)，說明空間轉(zhuǎn)錄組相關(guān)技術(shù)可以應(yīng)用于臨床。

建立了數(shù)據(jù)驅(qū)動框架（data-driven framework）用來鑒定空間轉(zhuǎn)錄組的類群，該方法還可以廣泛應(yīng)用于其他形態(tài)結(jié)構(gòu)不像皮質(zhì)薄層這么清晰的組織。

建立了一個網(wǎng)頁應(yīng)用程序，研究者們可以應(yīng)用這些數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

實(shí)驗(yàn)樣本

12 張厚度 10μm 的人腦背外側(cè)前額葉皮質(zhì)（DLPFC）組織切片。12 張切片來自 3 個不同供體，每個供體在位置垂直于 pial 表面取直接相鄰的兩片 10μm 組織作為空間重復(fù)，另在距離前 2 片組織 300μm 處取另外兩片相鄰的 10μm 組織。

平均每張切片測序量為 291.1M reads，每個 spot 平均包含 3.3 個細(xì)胞，每個 spot 平均檢測到 1,734 個基因和 3,462 個的 UMI。

分析方法

1. 通過描繪第 6 層（L6）和相鄰的白質(zhì)（WM）之間的邊界結(jié)合每個組織切片的灰質(zhì) / 神經(jīng)元，WM / 少突膠質(zhì)細(xì)胞和 L5 的標(biāo)記基因（SNAP25、MOBP 和 PCP4）識別 L5，確認(rèn)每個樣品的方向。

2. 在每個組織切片中將空間轉(zhuǎn)錄組的 spot 數(shù)據(jù)壓縮到 6 層加一個白質(zhì)水平（圖 A），主成分分析和 ANOVA，enrichment，pairwise 等模型都顯示了不同層之間的基因差異（圖 BCDE）。PCA 中主成分主要區(qū)分灰質(zhì)和白質(zhì)，第二個主成分主要區(qū)分不同層。

3. 本文研究者系統(tǒng)地評估了在成人 DLPFC 層富集基因表達(dá)數(shù)據(jù)集中先前鑒定的標(biāo)記基因的穩(wěn)健性。發(fā)現(xiàn)在之前報道中的層富集基因在空間轉(zhuǎn)錄組中也高度富集。并鑒定出了之前沒有報道過的 FABP7, ADCYAP1, PVALB 等層富集基因。原位雜交（ISH）和多路單分子熒光原位雜交（smFISH）技術(shù)也印證了空間轉(zhuǎn)錄組的鑒定出的新層富集基因。

4. 相關(guān)性熱圖顯示空間轉(zhuǎn)錄組的層富集基因和 snRNA-seq 的層富集結(jié)果有較高的相關(guān)性，同時結(jié)合 snRNA-seq 鑒定出的細(xì)胞類型結(jié)果確定了不同層的細(xì)胞類型。

5. 使用 SFARI 基因集數(shù)據(jù)庫（Abrahams et al., 2013）明確了和 ADS 相關(guān)的基因富集在 L2,L5 和 L6 層。已經(jīng)報道的 102 個 ASD 相關(guān)的基因集在空間轉(zhuǎn)錄組中富集在了兩個不同的層，53 個與自閉癥（ASD）相關(guān)的基因富集在 L5 層，另外 49 個與發(fā)育遲緩（DDID) 的經(jīng)驗(yàn)集富集在 L2 層，提示不同功能的神經(jīng)元亞類可能對每個臨床亞類有貢獻(xiàn)。

6. 使用三種不同的“數(shù)據(jù)驅(qū)動”方法對空間 spot 進(jìn)行聚類，這種“數(shù)據(jù)驅(qū)動”方法同樣適用于大腦的其他區(qū)域或者其他的組織。在每個樣本中使用 SpatialDE 方法 確定具有空間可變表達(dá)模式（SVGs）的基因集同時用 scran 包確定高變基因集。這兩個基因集都不含層流信息（laminar information）但是可以區(qū)分層流和非層流空間模式。比如 HBB,IGKC,NPY 等 SVGs 基因是非層流的，可能與血細(xì)胞，免疫細(xì)胞，抑制性神經(jīng)元等分類相關(guān)。

使用人工標(biāo)注的層結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，用校正后蘭德指數(shù)（ARI）比較了 unsupervised, semi-supervised and markers 三種方法的性能。semi-supervised 方法獲得 ARI。

注：文章中所使用的數(shù)據(jù)已及所有數(shù)據(jù)處理代碼都在網(wǎng)上提供（http://spatial.libd.org/spatialLIBD)。

總結(jié)

鑒于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)將分子細(xì)胞類型與連接的形態(tài)、生理和功能相關(guān)聯(lián)系起來的前景，這些方法將是神經(jīng)科學(xué)和精神病學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的下一個前沿。該文章也為空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用提供了一個新的思路和方向。

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